Kitaplar » Su Ürünleri Yetiştiriciliği » Mikro Alg Üretimi

Alt:küçük kaplarda devan eden alg üretim çalışmaları

     Proje başlangıcında Nannochloropsis sp. ve Phaeodactylum sp. türlerinin stok kültürleri ]aponya'dan getirilmiş ve Dunaliella sp., Cblorella spp., Chaetoceros sp. ve Skeletonema costatum türleri Türkiye sularından izole edilerek stok kültür oluşturulmuştur. Yapılan denemeler sonucu yoğun üretimde kullanılacak aday tür olarak Nannochloropsis sp. ve Phaeodactylum sp. seçilmiştir. Rotiferin küçük ölçekli hacimlerde üretim safhasında beslenmesi amacıyla Tetraselmis sp. kültürü de ele alınmıştır. Optimum sıcaklıklarda (200C ve 12.5°C) Nannochloropsis sp. ve Pbaeoductylum sp. türlerinin yoğunluğu ekimden (inokülasyon) bir hafta sonra sırasıyla 20x106 ve 2x106 hücre/ml'ye ulaşır.

     Uygulanan alg kültür prosedürü iki aşamadan oluşur:
Birinci aşama kapalı ortamda küçük ölçeklerde tam kontrollü olarak yapılır. Bunun beş üretim aşaması vardır. Bunlar; Test tüpü,200 ml erlen 5 i balon şişe 100 i silindir tank ve 1m3 tank,
İkinci aşama açık alanda büyük ölçeklerde yoğun kültürlerden oluşmaktadır ve iki üretim aşaması vardır.
1m3 tank ve 5 m3 tank ile 30 m3 hasat tankı
a.STOK KÜLTÜR GELİşTİRME ve MUHAFAZASI KÜÇÜK ÖLÇEKLİ ÜRETİM:
Küçük ölçekli üretim aşamalannda. test tüpleri 200 ml ve 5 IT'Iik cam balonlarda stok kültür üretimi gerçekleştirilir ve laboratuar şartlarından muhafaza edilir. Tamamen steril şartları sağlamak ve rotifer, protozoa ve diğer alg türlerinin kontaminasyon (bulaşma) riskini minimum düzeye indirebilmek için kuluçkahanenin diğer
bölümlerinden tamamen ayrı bir oda tahsis edi- lir. Bu alg stok odası, zemini klorlu su ile silinerek sterilize edilir. AIg kültüründen sorumlu eleman diğer kuluçkahane çalışmaları başlamadan önce stok kültür oluşturma çalışmalarını ta-
mamlamalı ve daha sonra diğer çalışmalarla ilgilenmelidir. Laboratuar içerisinde gereksiz malzemelerin tutulması ve ilgisi olmayan kişilerin bu bölüme girmeleri yasaklanmalıdır.

Üretilen alg türü için uygun büyüme koşullarını sağlayabilmek amacıyla stok kültür odasının sıcaklığı klima ile 18-220C arasında tutulur. Fotoperiyot veya gün uzunluğu, doğal gün ışığı tipi (2000-3000 lüks) floresan lambalar kullanılarak 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık olacak şekilde kontrol edilir.
Küçük ölçekli kültürlerde ve besi yerının hazırlanmasında kullanılacak tüpler ve kaplar dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Aksi taktirde, bu kaplardan bulasabilecek bileşikler alg kültürünün daha başlangıç safhalarında çökmesi-
ne yol açabilir. Bu safhada kullanılacak tüp ve diğer malzemelerin borosilikat camdan imal edilmiş olması tavsiye edilir.

Cam malzemeler bir gece boyunca fosfor içermeyen deterjanda tutulur, iyice fırçalanarak yıkanır ve daha herhangi bir deterjan kalıntısı kalmayacak şekilde iyice durulanır. Bu işlemden sonra malzemeler 0.1 N HCI'lik asit solüsyonunda yıkanır ve saf su ile durulanır. Daha sonra kurumak üzere tozsuz bir yere ağızları aşağı gele-
cek şekilde yerleştirilir veya etüvde kurutulur.

Arzu edilmeyen organizmaların kontaminasyonunu önlemek için, kültür kapları kullanılmadan önce otoklav veya etüv kullanılarak steril edilmelidir. (Otoklavda sterilizasyon 2 atm basınç ve 121•C'de 15 dakika)

Steril edilecek materyaller alüminyum folyo veya gazete kağıdı benzeri materyalle sarılarak otoklav içerisine tüm yüzeye buhar ulaşacak şekilde yerleştirilir. Kimyasal kontaminasyondan sakınmak için otoklavın su haznesinde saf su kullanılmalıdır. Sterilizasyon işlemi sırasında oluşan yüksek basınç sonucu oluşabilecek patlamalardan kaçınmak için kapların ağızları tam olarak kapatılmamalı hafif bir hava akımı sağlayacak boşluk bırakılmalı veya pamuk gibi malzemelerin üzeri alüminyum folyo ile kapatılarak hava girişi sağlanmalıdır.
 

     ETÜVDE STERİLİZASYON (KURU ISI) Kapların etüvden çıkarıldıktan sonra da iç kısımlarının steril kalmalarını sağlamak amacıyla boyun ve ağız kısımları alüminyum folyo ile kaplanır ve en az iki saat süre ile 160-180oC
sıcaklık uygulanır.

     Küçük hacimlerde geliştirilecek olan kültür için Walne veya f/2 stok solüsyonu formülasyonuna göre saf kimyasallar kullanılarak bir besi ortamı (medyurn) hazırlanır.

     Stok kültür için kullanılacak deniz suyu, kullanılmadan birkaç ay önce fiberglas filtreden (Whatman GF/C) geçirilerek muhafaza kaplarında tutulur. Bu dinlerıdirilmiş deniz suyu daha sonra küçük hacimli kültür ortamlarına dağıtılır ve otoklavda steril edilir. Minarellerin çökelmesini önlemek amacıyla deniz suyu ve besi ortamı ayrı ayrı steril edilir ve daha sonra steril şartlar altında karıştırılır.

     Kültürün küçük hacimlerden büyük hacimlere çıkarılması safhasında olası kontarninasyon riskini minimuma indirmek amacıyla test tüp kültürü dışında "parti kültür sistemi" adı verilen süreç kullanılır ve hiçbir zaman bir defadan fazla ekim yapılmaz.

     TEST TÜPLERİNDE ALG KÜLTÜRÜ
     Yoğun algal kültürün gelişimi test tüplerinde gerçekleştirilen kültürün kalitesine bağlı olduğundan, istikrarlı bir alg üretimi için saf stok kültür kullanılması özellikle tavsiye edilmektedir. Nitelikli ve saf alg stok kültürü, ya izolasyon teknikleri ile elde edilir ya da bilinen laboratuardaki orijinal stok kültürden satın alınır.

     Bu izolasyon işlemi için, içerisinde LO ml stok besi ortamı bulunan 20 kadar test tüpünün her birine steril pastör pipetle izole edilecek stok kültürden iki damla inokülasyon (ekim) yapılır. Stok kültürün saflığı, ortamın şeffaflığı, içerisinde topaklanmanın olmaması ve hızlı gelişme gibi parametrelere göre değerlendirilir. Ayrıca mikroskop altında incelenen örnekteki hücre büyüklüklerinin homojen olması da kültürle ilgili iyi bir göstergedir. Ekimi yapılan test tüplerindeki kültürler 200 ml'lik daha büyük hacimlere transfer edilmeden önce iki-üç hafta gelişmeleri sağlanır. Alg hücrelerinin test tüplerinin dip kısımda çökelmesini engellemek için, her gün dikkatli bir şekilde çalkalanmalıdır. Stok kültürün seçiminden sonra, kalan diğer temiz stoklar 2- 4°C'de üretim sezonundaki iş yoğunluğunu azaltmak amacıyla buzdolabında muhafaza edilir. Bu stoklar haftada bir kez çalkalanır. Şayet stoğun yüksek kondisyonu sürdürülebilirse, buzdolabında altı ay muhafaza edilebilir.

    200 ml HACİMLERDE ALG KÜLTÜRÜ
    200 ml'lik erlen kültüründe havalandırma sistemine gereksinim yoktur. Daha önceden 200 ml'lik erlen içerisinde 150 ml sterile edilmiş kültür solüsyonuna (besi ortamı) iyi kondisyondaki tek bir test tüpü seçilerek ekim yapılır. Erlen içerisinden bulunan COz alg gelişimini hızlandırır. Kültürün bu safhadaki gelişim süresi 4-7 gün arasında değişmektedir. Her sabah erlenin çalkalanması tavsiye edilmektedir.

55 Litrelik BALON JOJE KÜLTÜRÜ
Bu kültür için kullanılacak ünite; 5 lt'lik balonjoje, silikon tapa, havalandırma ve hava sağlayan cam borudan oluşmaktadır. Hava bolUsu 45 derecelik bir açıyla balonjoje kapağından çıkar. Kültür ortamının sirkülasyonu için kuvvetli havaIandırmaya (6 Itldak.) ihtiyaç vardır. Dışarıdan hava ile gelebilecek herhangi bir kontaminasyon riskini asgari seviyeye indirgemek için gelen hava pamuk ile filtre edilerek balonjojeye verilir. 200 ml'lik erlen içerisinde geliştirilen kültür, içerinde otoklavda sterilize edilmiş kültür besi ortamı bulunan 5 It'lik balonjojeye aşılanır. Nannocbloropsis yoğunluğu inokülasyondan 4-7 gün sonra 80-100x106 hücreımı'ye ulaşır. Bu yoğunluğa ulaşan kültür sera içerisinde bulunan 100 litrelik polikarbon tanklara aşılanabilir.

    BÜYÜK HACİMLERDE 000 i 'den 1 mve) ALG KÜLTÜRÜ
    Alg kültürünün bu safhası kuluçkahanenin diğer bölümlerden bağımsız olarak kurulmuş olan sera içerisinde yürütülmektedir. Burada herhangi bir kontaminasyonu önlemek için, kullanılan malzemeler %12 aktif klor ihtiva eden 300 ppm çamaşır suyu ilave edilmiş suda bekletilerek dezenfekte edilir. Nannochloropsis ve Pbaeo- dactylum, düşük konsantrasyonlardaki klora karşı tölerans gösterebildiklerinden, klorlu suda bekletilen malzemeler musluk suyu ile durulanmadan direkt olarak kullanılabilirler. Karadeniz'in tuzluluğu Fito/zoolankton kültürü için uygun seviyelerde olduğundan ( 15-18 psu - Pratik Tuzluluk Birimi), kültür ortamında kullanılan deniz suyunun tatlı su ilave edilerek seyreltilmesi gerekmemektedir.

     Sera içerisindeki tanklar polikarbon malzemeden yapılmış olup şeffaftır. 100-1000 litrelik polikarbon tanklar filtre edilmiş deniz suyuyla doldurulup, 300 ppm konsantrasyonunda çamaşır suyu ilave edilerek klor ile bir gece sterilizasyona tabi tutulur. Ertesi sabah, tanktaki su sodyum tiyosülfat solüsyonu ile birkaç dakika muamele edilerek klor nötralize edilir. Sterilizasyon süresince tank orta derecede havalandırılır. 100 ve 1000 litrelik kültür tankları için sırası ile 8 ve 22 i i dak havalandırma sağlanır.

     Tanklara zirai gübre ve 100 lt'lik kültür tanklarına 5 l'lik balon jojeden alg inokülasyonu yapılır. 100 lTıik bir tanktaki fitoplanktonun tümü 1 m3'lük tanka ekilir. Kültürün bu safhasında ekimi yapılacakNannochloropsis yoğunluğu genel olarak 2-5x106 hücreımı arasındadır ve yaklaşık bir hafta içerisinde hedeflenen fitoplankton yoğunluğu olan 30-60x106 hücreımı'ye ulaşır.

     Deniz suyunun dezenfeksiyonunda kullanılan çamaşır suyu (klorin), bunun nötralizasyonu ve Nannochloropsis ve Phaeodactylum kültürleri için kullanılacak gübre oranları Tablo 2'de özetlenmiştir.

     b.YOGUN (KİTESEL) ALG KÜLTÜRÜ

    Yoğun alg üretimi, bina dışına yerleştirilen 5-30 m3 hacme sahip fiberglass tanklarda yapılmaktadır. Fitoplankton gelişimini hızlandırmak için tanklar güneş ışınlarını direkt alabilecek şekilde yönleri doğudan batıya doğru olarak yerleştirilmelidir. Tanklar rotifer ve diğer protozoaların kuvvetli rüzgar veya diğer herhangi bir şekilde kontaminasyon riski göz önüne alınarak yerleştirilmelidir.

     Tankların temizlenip doldurulabilmesi için filtre edilmiş deniz suyu ve musluk suyuna kolayca ulaşılabilmelidir. Tanktaki alg hücrelerini iyice karıştırarak süspansiyon halinde tutmak amacıyla kuvvetli bir havalandırma yapılır. Bu amaçla, tankın tabanına tank duvarından 30 cm uzaklıkta 1.5 cm çapında bir hortum dairesel olarak monte edilir. Hortum üzerinde 10 cm aralıklarla 1 mm çapında havalandırma delikleri açılır. Ayrıca, daha iyi sirkülasyon sağlayabilmek için tankın merkezine doğru bir ya da iki havalandırma taşı yerleştirilir.

     Tankın dezenfeksiyonunda daha önce belirtilen esaslar uygulanır. 1 ve 5 m3 tanklarda yetiştirilen kültür sırasıyla 5 ve 30 m3 tanklara aşılanır. Nannochlorpsis kültüründe tankın başlangıçtaki su derinliği ayarlanırken ekimi yapılacak alg'nin yoğunluğu ve hacmi göz önüne alınmalıdır. Ekim yapıldıktan sonra tankın yoğunluğu 5-10x106 hücre/ml arasında ayarlanır ve hücre yoğunluğu 20x106 hücre/ml ulaştığında tanka dezenfekte edilmiş deniz suyu ilave edilerek tankın yoğunluğu 10x106 hücre/ml düşürülür. Proje çalışmalarında tanklarda . gözlenen alg gelişimine göre Nannocbloropsis kültüründe tanklardaki maksimum su derinliğinin kışın 40 cm, diğer mevsimlerde ise 80 cm olması tavsiye edilmektedir. Nannocbloropsis uı hedeflenen hücre yoğunluğu olan 20x106 hücre/ml seviyesine ilkbahar aylarında bir hafta içerisinde ulaşılmaktadır.
 

Alg üretim tankları

     Yoğun üretim tanklarında, verilecek olan gübrenin oranı ve veriliş sıklığı kültürün gelişimini kontrol ettiğinden, Tablo 2'de de görüldüğü gibi standart gübrenin üçte biri, üç günde bir olmak üzere tanklara verilir.

     Hedeflenen yoğunluğa ulaşan alg kültür, rotifer beslemede veya muhafaza amacıyla konsantre edilmeden önce sıcaklığı kontrol edilebilen tanklara transfer edilir. AIg kültürünün bir tanktan diğerine nakli spiral hortum takılmış olan dalgıç pompalarla yapılmaktadır. Bu işlem sırasında hortumun ucuna yerleştirilen 45 mikronluk plankton kepçesi ile alg filtre edilir.

    HÜCRE SAYIMI:
    İdeal şartlarda büyüme ve kontaminasyonun izlenmesi amacıyla her kültür partisinin hücre yoğunluğu günlük olarak ölçülmelidir.

     Fitoplanktonun hücre sayımı biyolojik mikroskop altında sayım kamarası (hemasitometre) kullanılarak yapılır. Sayım karnarası ortasında kalın dikdörtgen veya H şeklinde sayılacak fitoplankton hücrelerinin yerleştirileceği dairesel girintiler içerir. Kamaranın tipine göre derinliği 0.1 mm olan bir odacık oluşturan bir veya iki sayım alanı bulunur.

     Sayım amacıyla her bir kültür tankından alınan üçer örnek iyice karıştırılır. Pastör pipet kullanılarak örnekten bir damla sayım kamarasındaki odacığa tespit edilir. Örneğin sayım odacığına yerleştirilmesinde aşağıdaki hususlara
dikkat edilmelidir:

     'Sayım kamarası temizlenir ve %90'lık alkol içerisine konur. Kesinlikle toz ve yağdan arındırılmalıdır.

   . Lamel sayım kamarasının ölçümlendirilmiş (cetvelli) kısmına yerleştirilir.
    'Sayım kamarası ile lamel arasında Newton halkası (gökkuşağı renginde) oluşuncaya kadar lamel sıkı bir şekilde bastınlıp hafifçe döndürülür.

    'Bir damla örnek (lamelin karşılıklı kenarlarına kadar yayılacak miktarda) lamelin üstüne damlatılarak sayım odacığının içerisine girmesi sağlanır.

    'Örnek taşmaya sebep olacak kadar fazla veya sayım odacığını tam doldurmayacak kadar az olmamalıdır.

    -Petri kutusunun içerisine Örneğin buharlaşmasını önlemek için bir parça ıslak kağıt yerleştirilir. Sayım kamarası petri içerisine konarak hücrelerin çökmesi için 5 dakika bekletilir.

     Fitoplankton sayımında yaygın olarak, ölçümlendirme ve ebatlarına göre üç tip kamara kullanılmaktadır. Thoma tip sayım kamarasında en büyük karenin ebatları 1 mm x 1 mm' dir. Burker-Turk tipinde 3 mm x 3mm ve Neubauer
tipinde ise 4 mm x 4 mm'dir. Projede kullanılan sayım kamarası da 1 mm x 1 mm ebadında karelere sahip olup, aşağıda adı geçen büyük kareler 1 mm x Imm büyüklüğündedir

     Bu sayım odacığı büyük, orta ve küçük karelere sahiptir (Şekil 3 A, B ve C). Büyük karenin alanı (Şekil 3 A) Imm x Imm'dir. Büyük bir karede genellikle 16 veya 25 orta büyüklükte kare (Şekil 3 B) bulunurken, orta büyüklükte bir kare de 25 adet küçük kareye (Şekil 3 C) sahip.tir. Rastgele 5 tane orta (B) büyüklükte kare seçilerek, bu karelerde kalın çizgilerle çevrelenmiş olan alan içerisinde kalan tüm hücreler mikroskop altında 200-400 kez büyütülerek sayılır (Şekil 3). Eğer kültürün hücre yoğunluğu düşük ise büyük kare (A) içersindeki tüm hücreler sayılır. Sayımı yapılan kareyi çevreleyen üst ve sol kenar çizgisine dokunan hücreler sayılırken, alt ve sağ kenar çizgisine dokunanlar sayılmaz.
Kültürün hücre yoğunluğu aşağıdaki şekilde hesaplanır:

büyük havuzlar içerisinde alg üretimi

     -Orta büyüklükteki S karede sayılan toplam hücre sayısı: NI + N2 + N3 + N4 + N5
     =Orta büyüklükteki karedeki ortalama hücre sayısı: (NI + .... +N5)/5
     =Büyük kareler (A) 16 orta boy kare (B) içeriyorsa,
Sayım kamarasındaki toplam hücre sayısı; (Nl+ .... +N5)/5 x 16
     Sayım kamarasının hacmi; 1 x 1 x 0.1 (mm) = 0.1 mm '
-I ml = 10 x 10x 10 (mm) = 1,000 mm '

     • Buna göre fitoplankton hücre yoğunluğu (hücre/ml) aşağıdaki şekilde hesaplanabilir
(N1+ .. +NS)/S x 16 x 0,000/0.1) =( N1+ .. +NS)/S x 16 x 10,000
Şayet büyük kare (A) 25 orta boy kare (B) içeriyorsa,
Sayım kamarasındaki toplam hücre sayısı (hücre/ml); (Nl+ .... +N5)/5 x 25 x 10,000
Eğer büyük karenin tümü sayılırsa (A);
Fitoplanktonun yoğunluğu (hücre/ml) = N x 10,000

    KONTAMİNASYONU ÖN LEYİCİ TEDBİRLER

    Mikroskobik incelemenin yanı sıra günlük olarak her kültür tankı görsel olarak da kontrol edilmelidir. Kültür tankının yan duvarlarında kirlenme veya su yüzeyinde koyu yapışkan yeşil baloncuklar oluştuğu gözlenirse rotifer kontaminasyonu veya protozoa üremesinden şüphelenilmelidir. Bu gibi durumlarda, 1 ml kültür örneği stereomikroskop altında incelenmelidir. Herhangi bir kontaminasyon belirtisine rastlanmaması
durumunda, 5 litre örnek alınır ve 45 mikronluk plankton ağı kullanılarak yoğunlaştırılır (filtre edilir). Konsantre edilen örnek mikroskop altında incelenir. Eğer bu örnek içerisinde rotifer bulunursa, kültür tankına 15 ppm (15 ml/m.') çamaşır suyu (hipo-klorit) ilave edilerek 30 dakikalık uygulama yapılır. Daha sonra sodyum tiyosülfat 0.5 ppm=l.5 g/rrr') ortam ile nötralize edilmelidir. Ancak, rotifer yumurtaları bu uygulamadan sonra da yaşayabileceğinden, bir sonraki gün yeni açılmış olan rotiferleri öldürmek için aynı uygulama tekrarlanmalıdır.
Arzu edilmeyen protozaanların görüldüğü durumlarda da 30 dakika süreyle 50 ppm (50 rnl/m'') hipoklorit uygulaması yapılır ve sodyum tiyosülfat (5 ppm = 5 gr/m.') ile nötralize edilir.

     c.KÜLTÜRÜN KONSANTRE EDİLEREK MUHAFAZASI
     Larva üretim sezonunda işgücü kullanımını azaltmak, üretim sezanu dışında kültürün sürekliliğini sağlamak ve yoğun üretim esnasında acil kaynak olarak kullanılmak üzere hasat edilen planktonun bir kısmı veya tamamı polietilen içi oyuk fiberglass membran (0.1 mikron ağız açıklığı) konsantre makinası ile konsantre hale getirilmektedir. Konsantre edilen alg sıvı halde veya dondurularak muhafaza edilmektedir. Bu kültür bir yıldan daha fazla bir süre kalitesinde önemli bir değişim olmadan muhafaza edilebilir. Konsantre alg kuvvetli bir havalandırma sağlanan plastik kaplara stoklanır ve buzdolabında 1- 3°C'de muhafaza edilir. Bununla beraber, konsantre edilen alg plastik poşetlere nakledilerek -30°C'nin altında derin dondurucuda lipid içeriğini koruyabilmesi için muhafaza edilir. Konsantre edilen Nannocbloropsis ui yoğunluğu 5-6x109 hücre/ml ve Phaeodactylum ise 0.4-0.5x109 hücre/ml civarında olabilir.